Rekombinowany dna: opis, charakterystyka

Rekombinowany DNA to cząsteczka powstała w wyniku zastosowania laboratoryjnych technik rekombinacji genetycznej w celu połączenia materiału genetycznego pochodzącego z wielu źródeł. Jest to możliwe, ponieważ cząsteczki DNA wszystkich organizmów mają taką samą strukturę chemiczną i różnią się jedynie sekwencją nukleotydów w jej obrębie.

Tworzenie

Klonowanie molekularne to proces laboratoryjny stosowany do tworzenia rekombinowanego DNA. Jest to jedna z dwóch najczęściej stosowanych metod, obok łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). Pozwala ona kontrolować replikację dowolnej, wybranej przez eksperymentatora sekwencji DNA.

Istnieją dwie zasadnicze różnice pomiędzy metodami rekombinacji DNA. Jedną z nich jest to, że klonowanie molekularne wymaga replikacji w żywej komórce, podczas gdy PCR polega na replikacji in vitro. Kolejną różnicą jest to, że pierwsza metoda pozwala na wycinanie i wklejanie sekwencji DNA, natomiast druga wzmacnia się poprzez kopiowanie istniejącej sekwencji.

Wektor DNA

Wytwarzanie rekombinowanego DNA wymaga wektora klonującego. Pochodzi z plazmidów lub wirusów i stanowi stosunkowo niewielki segment. Wybór wektora do klonowania molekularnego zależy od wyboru organizmu gospodarza, wielkości klonowanego DNA i tego, czy obce cząsteczki mają być wyrażone. Segmenty mogą być łączone przy użyciu różnych metod, takich jak klonowanie restrykcyjne/ligazowe lub asemblery Gibsona.

Klonowanie

W standardowych protokołach klonowanie obejmuje siedem etapów.

1. Wybór organizmu gospodarza i wektora klonowania.
2. Uzyskanie wektora DNA.
3. Tworzenie sklonowanego DNA.
4. Tworzenie rekombinowanego DNA.
5. Wprowadzenie go do gospodarza.
6. Selekcja zawierających go organizmów.
7. Wybór klonów z pożądanymi wstawkami DNA i właściwościami biologicznymi.

Po przeszczepieniu do gospodarza obce cząsteczki zawarte w rekombinowanym konstrukcie mogą ulec ekspresji lub nie. Ekspresja wymaga restrukturyzacji genu, aby włączyć sekwencje, które są wymagane do produkcji DNA. Jest on wykorzystywany przez aparat translacyjny gospodarza.

Jak to działa

Rekombinowany DNA działa, gdy komórka gospodarza wyraża białko pochodzące z rekombinowanego genu. Ekspresja zależy od otoczenia genu zestawem sygnałów, które dostarczają instrukcji do jego transkrypcji. Należą do nich: promotor, wiązanie rybosomu i terminator.

Problemy pojawiają się, gdy gen zawiera introny lub sygnały, które działają jako terminatory dla gospodarza bakteryjnego. Prowadzi to do przedwczesnego zakończenia. Białko rekombinowane mogą być niewłaściwie obsługiwane, zsiadłe lub narażone na rozkład. Jego produkcja w systemach eukariotycznych zachodzi na ogół w drożdżach i grzybach strzępkowych. Komórki zwierzęce są trudne do wykorzystania, ponieważ wiele z nich wymaga stałej powierzchni nośnej.

Właściwości organizmów

Organizmy zawierające rekombinowane cząsteczki DNA mają pozornie normalne fenotypy. Ich wygląd, zachowanie i metabolizm są zazwyczaj niezmienione. Jedynym sposobem wykazania obecności sekwencji rekombinowanych jest zbadanie samego DNA za pomocą testu reakcji łańcuchowej polimerazy.

W niektórych przypadkach rekombinowany DNA może mieć działania niepożądane. Może się tak stać, gdy jego fragment zawierający aktywny promotor znajdzie się obok niemego wcześniej genu komórki gospodarza.

Korzystanie z

Technologia rekombinowanego DNA jest szeroko stosowana w biotechnologii, medycynie i badaniach naukowych. Jego białka i inne produkty można znaleźć w niemal każdej zachodniej aptece, klinice weterynaryjnej, gabinecie lekarskim, laboratorium medycznym lub biologicznym.

Najczęstszym zastosowaniem są badania podstawowe, gdzie technologia ta jest niezbędna dla większości nowoczesnych prac w naukach biologicznych i biomedycznych. Rekombinowany DNA jest używany do identyfikacji, mapowania i sekwencjonowania genów oraz określania ich funkcji. Sondy rDNA są wykorzystywane do analizy ekspresji genów w poszczególnych komórkach oraz w tkankach całych organizmów. Białka rekombinowane są wykorzystywane jako odczynniki w doświadczeniach laboratoryjnych. Poniżej podano kilka konkretnych przykładów.

Rekombinowana chymozyna

Znajdująca się w podpuszczce, chymozyna jest enzymem, konieczny dla produkcja serów. Był to pierwszy genetycznie zmodyfikowany dodatek do żywności zastosowany w. Produkowany mikrobiologicznie rekombinowany enzym, strukturalnie identyczny z tym pochodzącym od cielęcia, kosztuje mniej i jest produkowany w dużych ilościach.

Rekombinowana insulina ludzka

Prawie całkowicie zastępuje insulinę pochodzącą ze źródeł zwierzęcych (np. świń i bydła) w leczeniu cukrzycy insulinozależnej. Rekombinowaną insulinę otrzymuje się poprzez wstrzyknięcie genu dla insuliny ludzkiej do bakterii z rodzaju Etherachium lub drożdży.

Hormon wzrostu

Wspomagająco u pacjentów, u których przysadka mózgowa nie produkuje wystarczającej ilości hormonu wzrost dla wspieranie normalnego rozwoju. Zanim dostępny był rekombinowany hormon wzrostu, pozyskiwano go z przysadki mózgowej zwłok. Ta niebezpieczna praktyka doprowadziła u niektórych pacjentów do rozwoju choroby Creutzfeldta-Jakoba.

Rekombinowany czynnik krzepnięcia

Jest to białko krzepnięcia krwi, które podaje się pacjentom z postaciami hemofilii o zaburzonym krzepnięciu krwi. Nie są w stanie wyprodukować czynnika VIII w wystarczającej ilości. Zanim opracowano rekombinowany czynnik VIII, białko to wytwarzano poprzez przetwarzanie dużych ilości krwi ludzkiej od wielu dawców. Wiązało się to z bardzo dużym ryzykiem przeniesienia chorób zakaźnych.

Diagnoza zakażenia HIV

Każda z trzech powszechnie stosowanych metod diagnozowania zakażenia HIV została opracowana przy użyciu rekombinowanego DNA. Test przeciwciał wykorzystuje jej białko. Wykrywa obecność materiału genetycznego HIV za pomocą reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkrypcją. Przeprowadzenie testu było możliwe dzięki molekularnemu sklonowaniu i sekwencjonowaniu genomu HIV.