Białko rekombinowane: metody produkcji i zastosowania

Białko jest ważnym składnikiem wszystkich organizmów. Każda cząsteczka składa się z jednego lub więcej łańcuchów polipeptydowych zbudowanych z aminokwasów. Chociaż informacje potrzebne do życia są zakodowane przez DNA lub RNA, rekombinowane białka wykonują szeroki zakres czynności biologicznych funkcje w organizmach, w tym kataliza enzymatyczna, ochrona, wspomaganie, przemieszczanie i regulacja. Zgodnie z ich funkcjami w organizmie, substancje te można podzielić na różne kategorie, takie jak przeciwciała, enzymy, składnik strukturalny. Ze względu na ich ważne funkcje, związki te były intensywnie badane i szeroko stosowane.

W przeszłości głównym sposobem uzyskania rekombinowanego białka było wyizolowanie go z naturalnego źródła, co zazwyczaj było nieefektywne i czasochłonne. Ostatnie postępy w biologicznej technologii molekularnej umożliwiły sklonowanie DNA kodującego określony zestaw substancji do wektora wyrażającego substancje takie jak bakterie, drożdże, komórki owadów i komórki ssaków.

Mówiąc najprościej, rekombinowane białka są tłumaczone przez produkty egzogennego DNA w żywych komórkach. Ich produkcja zawiera zazwyczaj dwa główne etapy:

1. Klonowanie cząsteczki.
2. Ekspresja białka.

Wytworzenie takiej struktury jest obecnie jedną z najpotężniejszych technik stosowanych w medycynie i biologii. Związek ten ma szerokie zastosowanie w badaniach naukowych i biotechnologii.

Dziedzina medycyny

Białka rekombinowane dostarczają ważnych zabiegi różnych chorób, takich jak cukrzyca, nowotwory, choroby zakaźne, hemofilia i anemia. Wspólne związki obejmują przeciwciała, hormony, interleukiny, enzymy i antykoagulanty. Istnieje rosnące zapotrzebowanie na związki rekombinowane do zastosowań terapeutycznych. Rozszerzają możliwości leczenia.

genetycznie modyfikowane rekombinowane białka odgrywają kluczową rolę na rynku leków terapeutycznych. Obecnie większość środków leczniczych produkuje się w komórkach ssaków, ponieważ ich formuły są w stanie wytworzyć wysokiej jakości substancje zbliżone do naturalnych. Ponadto, wiele zatwierdzonych rekombinowanych białek terapeutycznych jest produkowanych w E. coli ze względu na dobrą genetykę, szybki wzrost i wysoką produkcję. Ma również pozytywny wpływ na rozwój leków opartych na tej substancji.

Prowadzenie badań

Produkcja białek rekombinowanych opiera się na różnych metodach. Substancje pomagają wyjaśnić podstawowe i fundamentalne zasady funkcjonowania organizmu. Cząsteczki te mogą być wykorzystane do identyfikacji i lokalizacji substancji kodowanej przez konkretny gen, a także do ujawnienia funkcji innych genów w różnych czynnościach komórkowych, takich jak sygnalizacja komórkowa, metabolizm, wzrost, replikacja i śmierć, transkrypcja, translacja i modyfikacja związków recenzowanych.

Dzięki temu recenzowane kompozycje są często wykorzystywane w biologii molekularnej, biologii komórki, biochemii, badaniach strukturalnych i biofizycznych oraz wielu innych dziedzinach nauki. Produkcja białek rekombinowanych jest praktykowana na całym świecie.

Takie kompozycje są użytecznymi narzędziami w zrozumieniu interakcji międzykomórkowych. Udowodniły one swoją skuteczność w kilku metodach laboratoryjnych, takich jak ELISA i immunohistochemia (IHC). Rekombinowane białka mogą być wykorzystywane do opracowywania testów enzymatycznych. W połączeniu z parą odpowiednich przeciwciał, komórki mogą być wykorzystane jako wzorce do zastosowania nowych technologii.

Biotechnologia

Rekombinowane białka zawierające sekwencję aminokwasów są również wykorzystywane w przemyśle, produkcji żywności, rolnictwie i bioinżynierii. Na przykład w przemyśle hodowlanym enzymy mogą być dodawane do żywności w celu zwiększenia wartości odżywczej składników paszy, zmniejszenia kosztów i odpadów, wspierania zdrowie jelitach zwierząt, poprawiają wydajność i zwiększają środowisko.

Ponadto bakterie kwasu mlekowego (LAB) są od dawna wykorzystywane do produkcji sfermentowanych produktów spożywczych, a ostatnio opracowano LAB do ekspresji rekombinowanych białek zawierających sekwencje aminokwasów, które mogą znaleźć szerokie zastosowanie, takie jak poprawa trawienia i odżywiania ludzi i zwierząt.

Jednak takie substancje mają również ograniczenia:

1. W niektórych przypadkach produkcja białek rekombinowanych jest skomplikowana, kosztowna i czasochłonna.
2. Substancje produkowane w komórkach mogą nie odpowiadać formom naturalnym. Różnica ta może zmniejszyć skuteczność terapeutycznych białek rekombinowanych, a nawet spowodować działania niepożądane. Ponadto, różnica ta może wpływać na wyniki eksperymentów.
3. Głównym problemem wszystkich leków rekombinowanych jest immunogenność. Wszystkie leki biotechnologiczne mogą wykazywać pewną formę immunogenności. Trudno jest przewidzieć bezpieczeństwo nowych białek terapeutycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, postępy w biotechnologii zwiększyły i ułatwiły produkcję białek rekombinowanych do różnych zastosowań. Chociaż nadal mają pewne wady, substancje te są ważne w medycynie, badaniach i biotechnologii.

Związek z chorobą

rekombinowane białko nie jest szkodliwe dla ludzi. Jest to tylko składnik całkowitej cząsteczki w rozwoju danego leku lub artykułu spożywczego. Wiele badań medycznych wykazało, że wymuszona ekspresja białka FGFBP3 (w skrócie BP3) u laboratoryjnego szczepu otyłych myszy wykazała znaczną redukcję ich masy tłuszczowej, pomimo genetycznej predyspozycji do jedzenia.

Wyniki tych eksperymentów wskazują, że białko FGFBP3 może oferować nowe terapie w zaburzeniach związanych z zespołem metabolicznym, takich jak cukrzyca typu 2 i otyłość wątrobowa. Ponieważ jednak BP3 jest naturalnym białkiem, a nie sztucznym lekiem, badania kliniczne rekombinowanej ludzkiej BP3 mogą się rozpocząć po ostatniej rundzie badań przedklinicznych. Na, istnieją powody związane z bezpieczeństwem takich badań. Białko rekombinowane szkoda dla nie szkodzi również ludziom, ze względu na jego stopniowe przetwarzanie i oczyszczanie. Zmiany zachodzą również na poziomie molekularnym.

PD-L2, jednego z kluczowych graczy w immunoterapii, który został nominowany do Nagrody Nobla w dziedzinie fizjologii i medycyny w 2018 roku. Prace te, zainicjowane przez prof. przez Allison z USA i prof. Tasuku Honjo z Japonii, doprowadziła do leczenia nowotworów takich jak czerniak, rak płuc i innych w oparciu o immunoterapię punktów kontrolnych. AMSBIO dodało niedawno nowy ważny produkt do swojej oferty immunoterapii - aktywator PD-L2 / TCR, SNO Recombinant Cell Line.

W eksperymentach typu proof-of-concept naukowcy z University of Alabama at Birmingham, kierowani przez X MD, PhD, pracowali nad nowym podejściem do immunoterapii.Long Zheng, prof. Robert B. Adams i dyrektor Medycyny Laboratoryjnej w Departamencie Patologii w UAB School of Medicine, zwrócił uwagę na potencjalną terapię rzadkiego, ale śmiertelnego zaburzenia krzepnięcia krwi, TTP.

Wyniki tego badania po raz pierwszy pokazują, że transfuzja płytek krwi obciążonych rADAMTS13 może być nowym i potencjalnie skutecznym podejściem terapeutycznym do zakrzepicy tętniczej związanej z wrodzoną i immunologiczną TTP.

Rekombinowane białko to nie tylko substancja odżywcza, ale również lek w przygotowaniu. To tylko kilka z obszarów, które są obecnie badane w medycynie. Międzynarodowa praktyka pokazuje, że struktura substancji jest w stanie, na poziomie molekularnym, zwalczyć wiele poważnych problemów w organizmie człowieka.

Opracowanie szczepionki

Rekombinowane białko to specyficzny zestaw cząsteczek, które można modelować. Podobna właściwość jest wykorzystywana w rozwoju szczepionek. Nowa strategia szczepień, znana również jako zastosowanie specjalnego zastrzyku z rekombinowanego wirusa, mogłaby ochronić miliony kurcząt zagrożonych poważną chorobą układu oddechowego - twierdzą naukowcy z Uniwersytetu w Edynburgu i Instytutu w Pirbright. Szczepionki te wykorzystują nieszkodliwe lub słabe wersje wirusa lub bakterie do mikroby wprowadzone do komórek organizmu. W tym przypadku eksperci wykorzystali rekombinowane wirusy z różnymi białkami kolców jako szczepionki, aby stworzyć dwie wersje nieszkodliwego wirusa. Istnieje wiele różnych narkotyki zbudowany na tym połączeniu.

Rekombinowane białko ma następujące nazwy handlowe i analogi:

1. "Fortelisin".
2. "Zaltrap".
3. "Eilea".

Są to głównie leki przeciwnowotworowe, ale istnieją inne obszary leczenia związane z tą substancją czynną.

Nowa szczepionka, zwana również LASSARAB, zaprojektowana w celu ochrony ludzi zarówno przed gorączką Lassa, jak i wścieklizną, wykazała obiecujące wyniki w badaniach przedklinicznych, zgodnie z nowym badaniem opublikowanym w czasopiśmie naukowym Nature Communications. Kandydacka inaktywowana szczepionka rekombinowana wykorzystuje atenuowany wirus wścieklizny.

Zespół badawczy wprowadził materiał genetyczny wirusa Lassa do wektora wirusa wścieklizny, dzięki czemu szczepionka wyrażała białka powierzchniowe zarówno w komórkach wirusa Lassa, jak i wścieklizny. Te kompozycje powierzchniowe wywołują odpowiedź immunologiczną przeciwko czynnikom zakaźnym. Taka szczepionka była następnie inaktywowana, aby "zabić" zastosowany żywy wirus wścieklizny zrobić nośnik.

Metody produkcji

Istnieje kilka systemów produkcji tej substancji. Powszechnie stosowana metoda wytwarzania białka rekombinowanego wywodzi się z syntezy materiału biologicznego. Ale są też inne metody.

Obecnie wyróżnia się pięć głównych systemów ekspresji:

1. System ekspresji E. Coli.
2. system ekspresji drożdży.
3. System ekspresji komórek owadów.
4. System ekspresji komórek ssaków.
5. System ekspresji białek bezkomórkowych.

Ta ostatnia opcja jest szczególnie przydatna do ekspresji białek transmembranowych i związków toksycznych. W ostatnich latach udało się wprowadzić do komórek in vitro substancje, które są trudne do ekspresji za pomocą konwencjonalnych środków wewnątrzkomórkowych. Na Białorusi szeroko stosuje się produkcję białek rekombinowanych. Istnieje szereg przedsiębiorstw publicznych zajmujących się tym zagadnieniem.

Bezkomórkowa synteza białek jest szybką i wydajną metodą syntezy substancji docelowych poprzez dodanie różnych substratów i kompozycji energetycznych wymaganych do transkrypcji i translacji w systemie enzymatycznym ekstraktów komórkowych. W ostatnich latach stopniowo ujawniły się zalety metod bezkomórkowych dla tego typu substancji, jako złożony, Toksyczne membrany, co wskazuje na ich potencjalne zastosowanie w dziedzinie biofarmaceutycznej.

Technologia bezkomórkowa może łatwo i w sposób kontrolowany dodawać różne aminokwasy nie występujące w naturze, aby osiągnąć złożone procesy modyfikacji, które są trudne do rozwiązania po konwencjonalnej ekspresji rekombinowanej. Metody te mają dużą wartość aplikacyjną i potencjał w zakresie dostarczania leków i opracowywania szczepionek z wykorzystaniem cząstek wirusopodobnych. Duża liczba białek membranowych została z powodzeniem wyrażona w wolnych komórkach.

Ekspresja związków

Rekombinowane białko CFP10-ESAT 6 jest produkowane i wykorzystywane do tworzenia szczepionek. Taki alergen gruźlicy pozwala na wzmocnienie odporności i wytworzenie przeciwciał. Ogólnie rzecz biorąc, badania molekularne obejmują badanie dowolnego aspektu białka, takiego jak struktura, funkcja, modyfikacje, lokalizacja lub interakcje. Aby zbadać, w jaki sposób określone substancje regulują procesy wewnętrzne, naukowcy zazwyczaj potrzebują środków do produkcji związków funkcjonalnych, które są przedmiotem zainteresowania i przynoszą korzyści.

Ze względu na rozmiar i złożoność białek, synteza chemiczna nie jest realną opcją dla tego przedsięwzięcia. Zamiast tego żywe komórki i ich mechanizmy komórkowe są zwykle wykorzystywane jako fabryki do tworzenia i konstruowania substancji na podstawie dostarczonych szablonów genetycznych. System ekspresji rekombinowanego białka, który następnie wytwarza strukturę niezbędną do stworzenia leku. Kolejnym krokiem jest wybór niezbędnych materiał dla różne kategorie leków.

W przeciwieństwie do białek, DNA można łatwo skonstruować syntetycznie lub in vitro przy użyciu dobrze znanych metod rekombinacji. W rezultacie matryce DNA określonych genów, z lub bez dodanych sekwencji reporterowych lub sekwencji znakowanych powinowactwem, mogą być konstruowane jako matryce do ekspresji. Takie kompozycje uzyskane z takich matryc DNA nazywane są białkami rekombinowanymi.

Tradycyjne strategie ekspresji substancji polegają na transfekcji komórek wektorem DNA zawierającym matrycę, a następnie hodowli komórek tak, aby dokonały transkrypcji i translacji pożądanego białka. Zazwyczaj komórki są następnie lizowane w celu ekstrakcji wyrażonego związku do dalszego oczyszczania. Rekombinowane białko CFP10-ESAT6 jest w ten sposób przetwarzane i poddawane systemowi oczyszczania pod kątem ewentualnego powstawania toksyn. Dopiero wtedy wchodzi do syntezy w szczepionkę.

Zarówno prokariotyczne, jak i eukariotyczne systemy ekspresji in vivo dla substancji molekularnych są szeroko stosowane. Wybór systemu zależy od rodzaju białka, wymagań dotyczących aktywności funkcjonalnej i pożądanej wydajności. Te systemy ekspresji obejmują ssaki, owady, drożdże, bakterie, algi i komórki. Każdy system ma swoje zalety i wyzwania, a wybór odpowiedniego systemu do konkretnego zastosowania jest ważny dla udanej ekspresji substancji omawianej w tym artykule.

Ekspresja u ssaków

Zastosowanie białek rekombinowanych pozwala na opracowanie różnych poziomów szczepionek i leków. Ta metoda otrzymywania substancji może być stosowana do tego. Systemy ekspresji ssaków mogą być stosowane do produkcji białek pochodzących od zwierząt, które mają najbardziej natywną strukturę i aktywność ze względu na ich fizjologicznie odpowiednie środowisko. Skutkuje to wysokim poziomem posttranslacyjnego przetwarzania i funkcjonalnej aktywności. Systemy ekspresji u ssaków mogą być wykorzystywane do produkcji przeciwciał, złożonych białek i związków do wykorzystania w badaniach funkcjonalnych opartych na komórkach. Jednakże te zalety, w połączeniu z bardziej rygorystycznymi warunkami hodowli.

Systemy ekspresji u ssaków mogą być wykorzystywane do produkcji białek tymczasowo lub poprzez stabilne linie komórkowe, w których konstrukt ekspresyjny jest zintegrowany z genomem gospodarza. Podczas gdy takie systemy mogą być wykorzystywane w kilku doświadczeniach, produkcja przejściowa może generować duże ilości w ciągu jednego do dwóch tygodni. Biotechnologia rekombinowanych białek tego typu cieszy się dużym zainteresowaniem.

Te przejściowe, wysokowydajne systemy ekspresji ssaków wykorzystują hodowle zawiesinowe i mogą dawać gramy na litr. Ponadto białka te mają bardziej natywne fałdowanie i modyfikacje potranslacyjne, takie jak glikozylacja, w porównaniu do inne systemy wyraz.

Ekspresja z owada

Metody wytwarzania rekombinowanego białka nie są ograniczone do ssaków. Istnieją metody bardziej efektywne pod względem kosztów produkcji, choć wydajność substancji z 1 litra przetwarzanej cieczy jest znacznie niższa.

Komórki owadzie mogą być wykorzystywane do ekspresji białek wysokiego poziomu z modyfikacjami podobnymi do systemów ssaków. Istnieje kilka systemów, które można wykorzystać do uzyskania rekombinowanego bakulowirusa, który następnie można wykorzystać do ekstrakcji interesującej nas substancji w komórkach owadów.

Ekspresję rekombinowanych białek można łatwo rozszerzyć i dostosować do hodowli zawiesinowej o dużej gęstości w celu produkcji cząsteczek złożonych na dużą skalę. Są one bardziej funkcjonalnie podobne do rodzimego związku ssaków. Chociaż wydajność może wynosić nawet 500 mg/L, produkcja rekombinowanego bakulowirusa może być czasochłonna, a warunki hodowli bardziej złożone niż w przypadku systemów prokariotycznych. Jednak w bardziej południowym i cieplejszym klimacie taka metoda jest uważana za bardziej efektywną.

Ekspresja bakteryjna

Produkcja białek rekombinowanych może być również osiągnięta za pomocą bakterii. Ta technologia znacznie różni się od tych opisanych powyżej. Bakteryjne systemy ekspresji białek są popularne, ponieważ bakterie są łatwe w hodowli, szybko rosną i dają wysoką wydajność rekombinowanych białek. Jednakże wielodomenowe substancje eukariotyczne wyrażane w bakteriach są często dysfunkcyjne, ponieważ komórki nie są wyposażone w urządzenia do przeprowadzania niezbędnych modyfikacji potranslacyjnych lub składania molekularnego.

Ponadto wiele białek staje się nierozpuszczalnych jako cząsteczki inkluzyjne, które są bardzo trudne do odtworzenia bez rygorystycznej denaturacji i późniejszych kłopotliwych procedur ponownego składania składu molekularnego. W większości przypadków metoda ta jest nadal w dużej mierze uważana za eksperymentalną.

Ekspresja bezkomórkowa

Rekombinowane białko zawierające sekwencję aminokwasową stafylokinazy jest wytwarzane w nieco inny sposób. Wchodzi w skład wielu rodzajów zastrzyków, wymaga kilku systemów przed użyciem.

Bezkomórkowa ekspresja białek to synteza in vitro substancji przy użyciu kompatybilnych z translacją ekstraktów całych komórek. W zasadzie ekstrakty całych komórek zawierają wszystkie makrocząsteczki i składniki, konieczny dla transkrypcję, translację, a nawet modyfikację potranslacyjną.

Do składników tych należą polimeraza RNA, białkowe czynniki regulatorowe, formy transkrypcyjne, rybosomy i tRNA. Po dodaniu kofaktorów, nukleotydów i specyficznej matrycy genowej, ekstrakty te mogą syntetyzować interesujące nas białka w ciągu kilku godzin.

Chociaż nie są stabilne w produkcji na dużą skalę, systemy ekspresji białek bezkomórkowych lub in vitro (IVT) oferują kilka zalet w porównaniu z konwencjonalnymi systemami in vivo.

Ekspresja bezkomórkowa pozwala na szybką syntezę preparatów rekombinowanych bez udziału hodowli komórkowych. Systemy bezkomórkowe pozwalają na znakowanie białek zmodyfikowanymi aminokwasami, jak również na ekspresję kompozycji, które ulegają szybkiej degradacji przez proteazy wewnątrzkomórkowe. Ponadto, łatwiejsza jest jednoczesna ekspresja wielu różnych białek przy użyciu metody bezkomórkowej (np. w celu badania mutacji białek poprzez ekspresję na małą skalę z wielu różnych matryc rekombinowanego DNA). W tym reprezentatywnym eksperymencie system IVT został użyty do ekspresji ludzkiego białka kaspazy-3.

Wnioski i perspektywy na przyszłość

Produkcję białek rekombinowanych można obecnie uznać za dyscyplinę dojrzałą. Jest to wynik licznych stopniowych ulepszeń w zakresie oczyszczania i analizy. Obecnie programy odkrywania leków rzadko są wstrzymywane z powodu niemożności wyprodukowania docelowego białka. Równoległe procesy robocze do ekspresji, oczyszczania i analizy wielu rekombinowanych substancji są obecnie dobrze ugruntowane w wielu laboratoriach na całym świecie.

Kompleksy białkowe i rosnący sukces w tworzeniu rozpuszczalnych struktur membranowych będą wymagały więcej zmian, aby nadążyć za popytem. Pojawienie się skutecznych kontraktowych organizacji badawczych zapewniających bardziej regularne dostawy białek spowoduje przesunięcie zasobów naukowych w celu sprostania tym nowym wyzwaniom.

Ponadto, równoległe przepływy pracy powinny umożliwiać tworzenie kompletnych bibliotek badanej substancji, aby umożliwić identyfikację nowych celów i wzmocnione badania przesiewowe, obok tradycyjnych projektów odkrywania leków małocząsteczkowych.